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随着生活水平的不断提高，食品质量和安全已成为全球日益重要的问题。肉类极易腐烂。在贮藏过程中，微生物和内源酶产生的生物胺（biogenic amines，BA）会引起过敏反应，如低血压、皮肤刺激、头痛，甚至死亡。因此，探索准确、高效的新鲜度检测技术对解决食品安全问题至关重要。
BAs是一种具有生物活性的小分子碱性含氮化合物，是食品新鲜度和安全性的重要指标。传统的检测方法包括气相色谱-质谱法、高效液相色谱等。这些方法需要昂贵的仪器和专业技术操作，因此阻碍了实际应用。荧光传感器具有简单、快速和高灵敏度等突出优点。常用的荧光探针包括碳点、香豆素等，其作为荧光部分，均可用于检测肉类变质过程中的BAs。然而，由于荧光团的聚集猝灭（aggregation-caused quenching，ACQ）现象，探针的传感能力通常局限于溶液状态，该局限性制约了这些探头在实时检测中的实际应用。而与ACQ不同的是，具有聚集诱导发射（aggregation-induced emission，AIE）特性的探针在固态和聚集态均显示出强烈的荧光。这一特性使AIE活性探头成为实际应用中最常用的发光材料之一。此外，某些探针可能表现出轻微的斯托克斯位移，导致荧光自吸收和信号串扰，最终降低检测精度。因此，创建和开发一种具有较大斯托克斯位移的AIE探头检测BAs，从而提高BAs检测的精度和灵敏度至关重要。
四邻亚苯（tetraphenylene，TPE）由于其合成简单、光稳定性好、发射效率高等优点，已成为AIE领域的一大亮点。此外，2-(2’-羟基苯基)-苯并噻唑（2-(2’-hydroxyphenyl)-benzothiazole，HBT）是一种具有激发态分子内质子转移（excited state intramolecular proton transfer，ESIPT）效应的荧光化合物，具有大的斯托克斯位移和高的荧光量子产率，使其成为构建分析物检测荧光探针的流行选择。
南京农业大学食品科技学院的Li Yuehui等将2 个传统的AIE（TPE）和ESIPT（HBT）荧光体相交，产生TPE-HBT。然后将羟基乙酰化，成功制备出一种新型的BAs比例荧光探针TPE-HBTAc。由于禁止ESIPT过程，TPE-HBTAc仅表现出AIE效应并产生蓝色荧光。然而，在BAs蒸气存在下，TPE-HBTAc上的乙酰基被选择性地裂解和释放。TPE-HBT同时表现出AIE和ESIPT效应，产生黄色荧光。而将荧光探针集成到具有三维聚合物网络的琼脂糖（agarose，AG）水凝胶中，形成检测BAs的水凝胶传感器，其可以作为高灵敏度包装传感的传感器，配合智能手机辅助分析系统检测鸡胸肉的新鲜度。
TPE-HBT在二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）中有292、447 nm的双吸收带。同时，TPE-HBT在446、530 nm处显示出分离良好的双发射带。然而，TPE-HBTAc未表现出双吸收或双发射带。相反，其吸收和发射峰分别出现在303、442 nm。不同比例的H2O/DMSO（fw）混合溶液中制备出11 组荧光探针溶液。随着水含量的增加，荧光光谱发生明显变化。较低的fw值（fw＝0%～40%）下，TPE-HBT表现出双发射（波长分别为446、530 nm）。当fw值从50%增加至90%时，短波发射完全消失，而长波发射红移至566 nm。荧光强度也随着fw值的增大而增大。当fw值低于50%时，能发出相对较短的波长光。然而，当fw值超过50%时，TPE-HBTAc的荧光发射逐渐增加，从442 nm红移至474 nm。
[TPE-HBT]＝5.0 μmol/L；[TPE-HBTAc]＝5.0 μmol/L；λex＝365 nm。
图1 TPE-HBT和TPE-HBTAc在DMSO中的紫外-可见吸收光谱（A）和荧光光谱（B）、TPE-HBT（C）和TPE-HBTAc（D）在不同比例H2O/DMSO溶液中的荧光光谱及紫外光下H2O/DMSO溶液中TPE-HBT和TPE-HBTAc的图像（E）该探测器在474 nm处发出淡蓝色峰。随着三甲胺（trimethylamine，TMA）含量的增加，探针在474 nm处的发射逐渐减弱，并出现了以566 nm为中心的新的红移发射带，并迅速增加。此外，在566 nm处观察到1 个清晰的发射点。发射比（I566 nm/I474 nm）是比例响应的显著特征。发射比（I566 nm/I474 nm）与TMA含量在0～12范围内呈良好的线性关系。检出限（limit of detection，LOD）低至65 nmol/L。
该探针对干扰剂中氨的反应是由于其一定的亲核性。芳香胺，由于p-π共轭而降低了亲核性，使得较难引起TPE-HBTAc的荧光响应改变。相反，脂肪胺的荧光发射比显著增加，其荧光强度为I566 nm/I474 nm。
A. H2O；B.乙醇；C. H2S；D.氨；E.苯胺；F. 2-甲基苯胺；G.酪胺；H.腐胺；I.尸胺；J.亚精胺；K.精胺；L.三乙胺；M.二甲胺；N.TMA。[TPE-HBTAc]＝5.0μmol/L。λex=365 nm。
图2 TPE-HBTAc溶液与不同当量TMA混合后在紫外光下的图像（a）、TPE-HBTAc在不同当量TMA下的荧光光谱（b）、添加TMA的TPE-HBTAc的发射比（I566 nm/I474 nm）及发射比（I566 nm/I474 nm）与TMA（0～12当量）的线性图（c）、TPE-HBTAc在12 当量下各种相关分析紫外光图像（d）、TPE-HBTAc在20当量相关分析物存在下的荧光光谱（e）和发射比（I566 nm/I474 nm）（f）由于乙酰基的保护，荧光探针TPE-HBTAc的ESIPT过程被抑制。假设BAs的加入由于氨基的亲核性而裂解了乙酰基，使探针TPE-HBTAc能够转化为TPE-HBT。为证实这一假设，在探针TPE-HBTAc和TMA的混合物上进行了1H核磁共振测试。苯环上H1、H2和H3的质子信号分别为7.94、7.83、6.86 ppm。此外，在加入TMA后，位于2.41 ppm的甲基信号减弱。
图3 TPE-HBTAc对TMA的传感机制（A）、TPE-HBTAc、TPE-HBTAc＋TMA和TPE-HBT在CDCl3中的1H核磁共振氢谱（B）AG具有紧密堆积的微观结构，而TPE-HBTAc-AG具有纤维状微结构和轻微疏松的结构，呈现多孔结构。结果表明，TPE-HBTAc成功地包裹在AG水凝胶中，而不需要经过化学修饰。即使在365 nm紫外灯连续照射25 h后，（R＋G＋B）/B值也未显著变化。在常规实验室条件下（避光），水凝胶传感器的（R＋G＋B）/B值在贮藏10 d后未显著变化。
图4 AG（A）和TPE-HBTAc-AG（B）的扫描电子显微镜图像、AG、TPE-HBTAc-AG和TPE-HBTAc的红外光谱（C）及TPE-HBTAc-AG在紫外光（D）和常规实验室条件（避光）（E）下的（R＋G＋B）/B值变化TPE-HBTAc-AG水凝胶传感器的（R＋G＋B）/B值随着TMA蒸气含量的增加而逐渐增加，并在20～180 ppm范围内呈良好的线性相关（R2＝0.993）。TMA蒸气的计算检出限为5.88 ppm。此外，在暴露于180 ppm TMA后，TPE-HBTAc-AG水凝胶传感器的（R＋G＋B）/B值大幅增加，并在12 min内稳定。
水凝胶传感器在接触干扰物（水、乙醇、硫化氢）时，无荧光变化。当接触脂肪胺时，荧光颜色从蓝色显著变化为黄色。然而，腐胺、精胺等BAs由于挥发性低，该传感器中不会产生显著的荧光变化。另一方面，对于芳香胺，由于p-π共轭导致亲核性降低，这些胺蒸汽不易断裂O-乙酰键，较难在该传感器上引起荧光变化。
图5 TPE-HBTAc-AG水凝胶传感器的合成（A）、TPE-HBTAc-AG水凝胶传感器在紫外光下暴露于TMA蒸气（0～220 ppm）后的图像（B）、TPE-HBTAc-AG暴露于TMA蒸气后的（R＋G＋B）/B值及（R＋G＋B）/B值与TMA蒸气（20～180 ppm）的线性曲线图（C）、TPE-HBTAc-AG暴露于TMA蒸气（180 ppm）后的（R＋G＋B）/B值（D）、TPE-HBTAc-AG在200 ppm各种相关分析物蒸气存在下的（R＋G＋B）/B值（E）水凝胶传感器在新鲜鸡胸肉4 ℃贮藏的第0天呈蓝色荧光，第4天变为绿色，第10天变为黄色。而当鸡胸肉在25 ℃贮藏时，TPE-HBTAc-AG水凝胶传感器也表现出相同的荧光从蓝色到黄色的变化趋势。
新鲜鸡胸肉的总挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量为6.4 mg/100 g，其在4 ℃条件下贮藏第4、6、10天分别为14.19、19.25、25.59 mg/100 g；其在25 ℃条件下贮藏第36、48、60小时分别为14.68、20.74、27.48 mg/100 g。在4、25 ℃下，TVB-N含量与TPE-HBTAc-AG水凝胶传感器的Pearson相关系数分别为0.971和0.988。结果表明，TPE-HBTAc-AG的（R＋G＋B）/B值与鸡胸肉的TVB-N含量呈显著正相关。
图6 TPE-HBTAc-AG水凝胶传感器在紫外光下4、25 ℃下检测鸡肉新鲜度的图像（A）、鸡肉在4 ℃（B）和25 ℃（C）变质过程中（R＋G＋B）/B和TVB-N含量发生变化及其相关性（D、E）本研究开发了一种新的比例荧光探针TPE-HBTAc，用于灵敏地检测肉类腐败产生的BAs。该探头基于AIE和ESIPT，具有较大的斯托克斯位移和良好的光稳定性。它对生物胺TMA具有较低的检测限（LOD＝65 nmol/L），并显示了比例荧光的显著变化。该探针具有亲核特性，能在AIE和ESIPT的共同作用下裂解乙酰基释放TPE-HBT。此外，以AG凝胶为基质，将TPE-HBTAc荧光探针制成BAs水凝胶传感器。TMA的存在导致了从蓝色到黄色的转变，无需任何设备即可观察到。（R＋G＋B）/B值在20～180 ppm范围内呈良好的线性关系（R2＝0.993），检出限较低（5.88 ppm）。该水凝胶传感器与智能手机的RGB分析系统配合使用，成功监测了鸡胸肉样品在25 ℃（48 h）和4 ℃（10 d）时的新鲜度变化。水凝胶传感器在肉类变质的3 个阶段（新鲜、轻微变质和严重劣变）从蓝色到绿色再到黄色，颜色变化明显，易识别。综上所述，TPE-HBTAc-AG水凝胶传感器可以作为监测鸡胸肉新鲜度的良好指示剂。
文章《An AIE and ESIPT based ratiometric fluorescent hydrogel sensor for detecting biogenic amines and chicken breast freshness》发表于Microchemical Journal 2024年204卷南京农业大学食品科技学院黄明教授为本文通信作者文章链接：https://doi.org/10.1016/j.microc.2024.111018
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