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动物源抗氧化肽是一类来源于动物蛋白质的小分子肽段，具有抗氧化活性和生理功能。肉类动物屠宰后，肌肉中发生一系列生理生化变化，特别是在内源酶作用下进行一系列生化反应，最终完成肉的成熟过程，在此过程中部分肌原纤维蛋白在内源酶的作用下会发生降解，产生多肽。富集原料中的抗氧化肽不仅可提高原料质量，促进后续加工，也可有效减轻氧化、腐败和酸味的形成。物理场结合宰后成熟可以更大程度的促进酶的释放和蛋白水解。
南京农业大学食品科学技术学院高源、黄明教授等以番鸭为研究对象，采用超声结合宰后成熟方法处理番鸭胸，探究超声协同成熟处理对番鸭源抗氧化肽的影响，阐明适宜富集鸭肉抗氧化肽的最优超声和成熟条件；进一步探究番鸭源多肽经不同加工处理和体外模拟胃肠消化后抗氧化活性的变化规律；对抗氧化活性最强的多肽进行超滤、凝胶层析、反相液相逐级分离纯化，阐明超声协同成熟处理后番鸭源多肽具有抗氧化活性的肽序列，并对其抗氧化活性进行人工合成验证，探究其发挥抗氧化活性的机制。为提高肉品营养品质提供一条有前景的途径。
由图1A可知，随着宰后成熟时间的延长，在相同超声功率下，蒸煮损失率呈现先减小后增大的趋势；在相同的宰后成熟时间下，与对照组相比超声处理后鸭胸的蒸煮损失率更小，说明超声处理能够提高番鸭的保水性，从而对番鸭的品质产生有利影响。在宰后成熟168 h时，对照组和超声组蒸煮损失率均达到峰值。同样，在图1B中，在相同超声功率下，鸭胸剪切力随着宰后成熟时间的延长呈下降趋势。在同一宰后成熟时间，超声处理组番鸭胸的剪切力小于对照组。因此，超声处理能提高番鸭胸的嫩度，降低其蒸煮损失率。在图1C中，宰后成熟早期（0～6 h），超声处理组和对照组中的肽含量均下降，从宰后成熟6～72 h，对照组和1050 W超声组的肽含量均呈稳定增长的趋势，于成熟72 h时达到最大。
小写字母不同表示不同超声功率、相同宰后成熟时间差异显著（P＜0.05），大写字母不同表示相同超声功率、不同宰后成熟时间差异显著（P＜0.05）。下同。
图1 宰后成熟时间和超声处理对鸭胸肉蒸煮损失率（A）、剪切力（B）、鸭胸肉浸提肽含量（C）的影响超声组和对照组的游离氨基酸含量如表1所示，对照组鸭胸肉中的游离氨基酸在成熟0～6 h显著降低（P＜0.05），在成熟6 h达到171.59 mg/100 g；之后随着成熟时间的延长，游离氨基酸含量显著升高，于成熟168 h时游离氨基酸的总量达到最大值，为322.53 mg/100 g；在超声处理下，鸭胸肉的游离氨基酸的变化趋势与未超声时一致，在成熟0～6 h时显著降低（P＜0.05），在宰后成熟6 h游离氨基酸总量下降至231.37 mg/100 g；随着成熟时间的延长，游离氨基酸含量显著升高，成熟168 h游离氨基酸的总量达到最大，为324.17 mg/100 g。在相同成熟时间下，1050 W超声处理后鸭胸肉中游离氨基酸含量较未超声处理组高，表明超声处理可增强蛋白质水解作用。
表1 超声结合宰后成熟过程中游离氨基酸的变化（mg/100 g）
注：同行字母不同表示差异显著（P＜0.05）。
如图2A所示，超声处理结合宰后成熟72 h后，番鸭源多肽抗氧化能力达到最大。在相同超声功率下，随着宰后成熟时间从6 h延长至72 h，多肽对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力逐渐增强，在成熟72 h达到峰值，对照组和1050 W超声组对DPPH自由基清除率分别为41.66%和47.38%。1050 W超声组在相同宰后成熟时间对DPPH自由基清除能力较对照组显著增强（P＜0.05），成熟72 h时DPPH自由基清除率提高5.72%。
A. DPPH自由基清除能力；B. ABTS阳离子自由基清除能力；C. ·OH清除能力；D. FRAP值；E.超声功率为0 W时肽的二级结构含量；F.超声功率为1050 W时肽的二级结构含量。
图2 抗氧化活性
如图2B所示，1050 W超声组在成熟时间0～24 h时对2,2′-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）阳离子自由基清除率在一定范围内波动，72 h时急剧升高，达到211.23 μmol TE/g。而对照组表现出先下降后稳定上升的趋势，于72 h达到最大值为192.37 μmol TE/g。宰后成熟72h, 1050 W超声处理组ABTS阳离子自由基清除能力较对照组显著提高18.86 μmol TE/g（P＜0.05）。
如图2C所示，随着宰后成熟时间从6 h延长至72 h，多肽对·OH清除能力逐渐增强，在成熟72 h达到峰值，对照组和1050 W超声组对·OH清除率分别为28.37%和31.71%。1050 W超声组在相同宰后成熟时间对·OH清除能力较对照组有显著增强（P＜0.05），成熟72 h时·OH清除率提高3.35%。
如图2D所示，铁离子还原能力（ferric reducing antioxidant power，FRAP）与DPPH自由基清除率结果具有相似的趋势，随着宰后成熟时间从6 h延长至72 h，FRAP值逐渐增大，在成熟72 h达到峰值，此时对照组和1050 W超声组的FRAP值分别为21.49%和25.48%。1050 W超声组在相同宰后成熟时间对FRAP值较对照组有显著增强（P＜0.05），成熟72 h时，FRAP值提高3.99%。综上所述，4 种评估多肽抗氧化活性的方法均表明1050 W超声处理与宰后成熟72 h相结合对番鸭源多肽抗氧化活性产生了最显著的影响。
如图2E、F所示，不同成熟时间对番鸭肌原纤维蛋白的二级结构无显著影响。但在相同成熟时间下，1050 W超声组的β-结构相对含量高于对照组，α-螺旋相对含量低于对照组。其中，1050 W超声组在宰后成熟72 h时β-结构相对含量最大（43.53%），α-螺旋相对含量最少（28.13%）。这一结果与1050 W超声处理协同成熟72 h后表现最强大抗氧化活性结果一致。
如图3A～E所示，内源蛋白酶活随着成熟时间的延长逐渐降低，其中组织蛋白酶D、H在成熟168 h时仍保持较高的活性，与其他内源酶相比较稳定。除组织蛋白酶B外，1050 W超声处理组的内源酶活性显著高于对照组。因此，适当的超声处理可以增强组织蛋白酶和钙蛋白酶的活性，这可能是1050 W组肽含量高于对照组的原因。
A.组织蛋白酶B；B.组织蛋白酶D；C.组织蛋白酶H；D.组织蛋白酶L；E.钙蛋白酶活力。
图3 内源性酶活性
根据抗氧化活性指标在宰后成熟72 h达到最大值，选取成熟时间为72 h观察番鸭胸肌原纤维的微观结构。如图4A～D所示，在未超声的情况下，宰后成熟0 h的肌节排列均匀，Z线、I带、A带、M线清晰可见；然而，在宰后成熟72 h，肌节出现部分损伤。此外，随着宰后成熟时间的延长，肌原纤维间线粒体变大，数量增加。在1050 W超声处理下，成熟0 h时，肌原纤维损伤明显，M线变暗，肌节变暗；成熟72 h时，肌节几乎完全消失，M线和Z线都变暗。因此，超声协同宰后成熟处理会破坏肌原纤维结构。
蓝色单向箭头.Z线；红色单向箭头.M线；双向箭头.完整肌节。
图4 不同宰后成熟时间和超声功率对番鸭胸肌原纤维微结构的影响对1050 W超声处理结合宰后成熟72 h组多肽进行凝胶过滤层析（ gel filtration chromatography，GFC）分离，得到图5A所示的3 个组分。3 个组分相应的抗氧化活性如图5B所示，F1具有最高的抗氧化能力，DPPH自由基清除能力为42.19%，FRAP值为25.49 μmol Fe2+/g。F2和F3抗氧化活性降低可能是因为大量FAAs的存在，其不具有抗氧化活性。因此选用F1进行反相高效液相色谱（reversed-phase high performance liquid chromatogra，RP-HPLC）。利用RP-HPLC对GFC分离得到的F1进行分离纯化，得到的图谱如图5C所示。各组分相应的抗氧化活性如图5D所示，在9 个峰中，P1具有最强抗氧化能力，DPPH自由基清除率为55.06%，FRAP值为44.09 μmol Fe2+/g，故选用P1，利用液相色谱-串联质谱联用鉴定肽序列。
小写字母不同表示FRAP值差异显著（P＜0.05），大写字母不同表示DPPH自由基清除能力差异显著（P＜0.05）。
图5 GFC洗脱谱图（A）、分离部位抗氧化活性（B）、RP-HPLC洗脱谱图（C）、各分离部位抗氧化活性（D）这些合成多肽的抗氧化活性如表2所示，结果表明，人工合成验证后ENHHCCC具有最强的抗氧化活性，DPPH自由基清除率为91.29%，ABTS阳离子自由基清除率为207.37 μmol Fe2＋/g，·OH清除率为47.11%，其抗氧化活性与GSH相近。这些结果也证实了小分子肽具有生物活性。AMGIMNSFVNDIFER和AVFVDLEPTVIDEVR具有较高的抗氧化活性，DPPH自由基清除率分别为66.93%和59.62%，ABTS阳离子自由基清除率分别为187.90 μmol Fe2＋/g和175.28 μmol Fe2＋/g；ELEAELEDER具有较高的·OH清除能力和ABTS阳离子自由基清除能力，分别为45.44%和182.85 μmol Fe2＋/g。
表2 具有高抗氧化活性的P1成分的肽序列
注：以谷胱甘肽为对照。同列小写字母不同表示差异显著（P＜0.05）。
超声处理能够提高番鸭胸肉的保水能力，降低蒸煮损失率。番鸭多肽含量随着宰后成熟时间的延长而增加。在宰后成熟0～72 h番鸭源多肽对DPPH自由基、·OH、ABTS阳离子自由基清除能力和FRAP值呈先减小后增加的趋势，抗氧化活性于宰后成熟72 h达到最大值。与对照组相比，1050 W超声处理能够显著提高多肽含量和抗氧化活性，且超声组在宰后成熟72 h时抗氧化能力最强。1050 W超声处理与宰后成熟72 h相结合对番鸭源多肽抗氧化活性产生了最显著的影响。超声处理后，肌原纤维结构被破坏，组织蛋白酶B、D、H、L和钙蛋白酶活性均增强，多肽β-折叠和β-转角相对含量增大。将经1050 W超声处理和宰后成熟72 h的番鸭源多肽进行超滤，将＜3 kDa的组分进行GFC分离，得到3 个峰，其中F1抗氧化活性最强。利用RP-HPLC对F1进一步分离纯化，得到9 个峰，其中P1抗氧化活性最强。选取P1进行多肽序列鉴定，共鉴定出87 条肽段序列，根据置信度和多肽强度筛选出9 条活性较强的抗氧化肽序列，序列的长度范围为7～20 个氨基酸，人工合成验证后ENHHCCC具有最强的抗氧化活性，DPPH自由基清除率为91.29%，ABTS阳离子自由基清除率为207.37 μmol Fe2＋/g，·OH清除率为47.11%，抗氧化能力与谷胱甘肽相似。
文章《Ultrasound combined with post-mortem aging enriches antioxidant peptides in Muscovy ducks》发表于LWT-Food Science and Technology 2024年205卷南京农业大学食品科技学院黄明教授为本文通信作者文章链接：https://doi.org/10.1016/j.lwt.2024.116482
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