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产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）是一种厌氧、产孢子的革兰氏阳性病原菌。产气荚膜梭菌A型是食品工业中导致细菌性食源性疾病的常见原因。孢子在自然界中普遍存在，对多种环境胁迫具有高度抗性。其中，一些处于休眠状态的孢子，如超级休眠孢子，可以在肉类加工中的较高温度下存活、发芽，转化为营养细胞，并在有利条件下生长。食用超过6 （lg CFU）活性的产气荚膜梭菌可诱发食源性疾病，其特征为腹泻和严重的腹痛等症状。
目前，控制产气荚膜梭菌孢子主要采用物理和化学方法。热处理和高压处理是食品工业中灭活产气荚膜梭菌主要的物理技术。而更强烈的处理条件或物理技术的协同作用才能有效地灭活产气荚膜梭菌孢子，但其对营养和感官质量有不利影响。此外，即使是较高水平的化学物质，对产气荚膜梭菌孢子的灭活效果也十分有限。因此，探索其他方法控制产气荚膜梭菌孢子十分必要。
自然界中，孢子可以通过营养物质芽源转化为营养体细胞，主要包括盐、氨基酸和糖。当一种或多种芽源受体（germinant receptors，GRs）感知其同源芽源时，孢子萌发被激活。GR蛋白由单顺反子基因gerAA、双顺反子基因gerKA-KC操纵子以及上游反向方向的gerK编码。大多数芽源主要通过产气荚膜梭菌孢子中的GerKC和GerKA蛋白起作用。然而，GerAA蛋白在孢子萌发中起辅助作用。在发芽剂与GR蛋白结合后，将启动一系列生化反应。初始过程涉及释放单正离子和吡啶-2,6-二羧酸（pyridine-2,6-dicarboxylic acid，DPA）。随后，肽聚糖皮质进行水解，导致孢子核心完全水合。该过程标志着孢子的整个萌发。一旦萌发阶段完成，孢子很容易被灭活。研究证实，KCl是诱导孢子萌发的最优萌发剂。此外，通常使用混合萌发剂诱导孢子萌发。其中，L-天冬氨酸、D-葡萄糖、D-果糖和KCl的混合物（L-asparagine, D-glucose,D-fructose, and KCl，AGFK）在触发孢子萌发方面效果最好。
图1 实验设计
产气荚膜梭菌是鸡肉中重要的病原体之一。据报道，人类近30%的产气荚膜梭菌病例来自鸡肉。就微生物的安全性而言，商业灭菌能够灭活孢子，是熟制品常用的方法。然而，灭菌温度可能影响产品的质量。为了在维持品质的同时使孢子失活，有必要在灭活前诱导孢子发芽，从而促进其被破坏的可能性。研究表明，经过中度加热处理（90 ℃、20 min）后，一些产气荚膜梭菌孢子仍然具有活性。因此，产气荚膜梭菌孢子的萌发表现出异质性，需要多样化的处理条件诱导更多孢子的萌发。程序化温度处理（programmed temperature control，PTC）是一种使用预设程序精确控制温度的方法，可用于多样化处理条件，以针对孢子的萌发特性。假设PTC处理可以诱导更多处于不同休眠状态的孢子萌发，如超休眠孢子，从而导致更大程度的失活。
对于经过熟制和冷却过程的商业熟鸡肉产品，产气荚膜梭菌孢子可能与未经加热冷却的生肉中存在的孢子表现出不同程度的异质性。然而，相关研究及基于发芽孢子失活的研究较少。合肥工业大学中国轻工业肉类微生物控制与利用重点实验室、食品与生物工程学院的Xiao Qing等研究了在熟鸡肉中添加不同发芽剂时PTC处理对产气荚膜梭菌孢子的失活效果和机制。
对照组、KCl组和AGFK组中，熟制分别导致孢子减少0.24、0.14、0.32（lg （CFU/mL））。激活处理后，对照组、KCl组和AGFK组的产气荚膜梭状孢子灭活率分别为1.38、1.80、2.37 （lg （CFU/mL））。
在激活和萌发处理后，观察到大量孢子萌发。在灭活处理后，对照组、KCl组和AGFK组在80 ℃处理20 min分别使2.81、3.26、4.06 （lg （CFU/mL））的孢子灭活，而90 ℃处理20 min后，3.43、4.14、6.04 （lg （CFU/mL））孢子灭活。此外，在脑心浸液肉汤（brain heart infusion，BHI）培养基中用30% KCl代替NaCl显著增加了整个发芽过程中孢子的萌发程度，但低于AGFK（P＜0.05）。
大写字母不同，表示相同发芽剂处理在不同组之间差异显著（P＜0.05），小写字母不同，表示不同发芽剂处理在相同处理之间差异显著（P＜0.05）。下同。
图2 PTC处理发芽剂对BHI培养基中产气荚膜梭菌孢子的灭活效果冷却后，各处理组gerKA基因表达量均上调。冷却后，AGFK组gerKA和gerAA基因表达量显著高于对照组和KCl组（P＜0.05）。冷却后，AGFK、KCl组gerKC基因表达量与对照组之间差异显著（P＜0.05）。在AGFK组，gerKA、gerKC和gerAA基因表达量在萌发后分别上调2.5、1.1、2.6 倍。
图3 熟制、冷却和萌发处理后的产气荚膜梭菌孢子gerKA（A）、gerKC（B）、gerAA（C）基因的相对表达量在整个发芽期内，3 组DPA释放含量逐渐增加，各组熟制后释放25%～26% DPA。冷却后，各组孢子的DPA释放均显著增加（P＜0.05）。AGFK组的DPA释放含量显著高于对照组和KCl组。发芽处理后，对照组、KCl和AGFK组DPA的释放量分别为54.51%、59.09%和66.53%。
图4 产气荚膜梭菌孢子萌发全过程中的DPA释放3 组的光密度（optical density，OD）600 nm在整个发芽过程中逐渐下降。冷却后孢子OD600 nm显著降低（P＜0.05）。在OD600 nm中，至少20%的减少是显著发芽。发芽处理后，AGFK组的OD600 nm显著低于对照组和KCl组（P＜0.05）。
图5 产气荚膜梭状菌孢子发芽过程中OD600 nm变化经过激活处理后，对照组和KCl组的产气荚膜梭菌孢子分别灭活2.24、2.19 （lg （CFU/g））。
此外，随着发芽过程的延长，孢子的减少量显著增加。在对照组和KCl中，经过灭活后，孢子减少量为3.77、3.78 （lg （CFU/g））。然而，用30% KCl代替NaCl并没有增强孢子的灭活效果。当用AGFK诱导孢子萌发时，激活和灭活（90 ℃）后分别2.49、4.97 （lg （CFU/g））的孢子被灭活，孢子灭活率显著高于对照组和KCl组（P＜0.05）。BHI培养基中的产气荚膜梭菌孢子失活显著高于熟制肉（P＜0.05）。
图6 PTC处理与发芽剂对熟鸡肉中产气荚膜梭菌孢子灭活效果的影响研究表明，PTC处理可以启动更多处于不同休眠水平的孢子萌发，然后立即加热灭活萌发的孢子，能够增强孢子的灭活。
图7 PTC处理对产气荚膜梭菌孢子灭活机理示意图
为了有效灭活商业熟鸡肉中的产气荚膜梭菌孢子，提出了一种名为PTC的处理工艺。在BHI培养基和90 ℃加热20 min的熟鸡肉中，PTC和发芽剂AGFK联合使用分别导致6.04 （lg（CFU/mL））和4.97 （lg （CFU/g））的灭活。在PTC处理过程中，gerKA、gerKC和gerAA相对表达量上调表明该过程可能促进更多孢子发芽，孢子DPA释放增加和孢子折射率降低也证明了这一点。PTC和发芽剂AGFK组合处理可能是熟肉制品中常规热灭菌的潜在替代方法，降低了灭活孢子所需的热处理温度。
文章《Programmed temperature control for inactivation of Clostridium perfringens spores in cooked chicken with different germinants》发表于Food Bioscience 2024年61卷合肥工业大学食品与生物工程学院李沛军教授为本文通信作者
文章链接：
https://doi.org/10.1016/j.fbio.2024.104625
专家介绍
李沛军，教授，博士生导师，合肥工业大学肉品绿色制造与品质调控创新团队骨干成员，入选国家级青年人才奖励计划。担任中国轻工业肉品微生物控制及利用重点实验室副主任、中国食品科学技术学会青年工作委员会委员、中国畜产品加工研究会青年工作委员会委员、中国食品科学技术学会非热加工技术分会委员、《食品研究与开发》和《肉类研究》等期刊编委。主要从事微生物与肉品质量安全控制研究，在肉用微生物资源挖掘和菌株功能（呈色、抑菌/生物保护、促进风味形成和消减危害物等）开发利用等方面取得积极进展。主持国家重点研发计划课题、国家自然科学基金等项目10余项，以第一/通信作者发表学术论文50余篇，副主编和参编教材/著作7 部，申请和授权PCT和国家发明专利20余项，获评安徽省教坛新秀，获得省部级科技进步一等奖2 项。
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