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布鲁氏菌病研究进展
现代畜牧网 http://www.cvonet.com 2020/8/3 10:31:49 关注：936 评论： 我要投稿
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摘要：布鲁氏菌病的早期诊断及鉴定是该病防控的重要环节，其诊断技术主要包括细菌学诊断技术、血清学诊断技术以及分子生物学诊断技术。布鲁氏菌病防控应坚持预防为主的策略，其免疫主要以弱毒活疫苗为主，随着分子生物学及重组DNA技术的发展，基因工程疫苗成为近年研究热点，但目前尚未有鉴别疫苗免疫和自然感染的鉴别诊断技术及相应的疫苗制品。本文对布鲁氏菌病的病原学、流行病学、诊断技术和疫苗研究进展等方面进行概述，以期为建立灵敏性高、特异性强、高效便捷且易推广的布鲁氏菌病诊断技术和研发更加安全有效的布鲁氏菌病疫苗提供基础。
布鲁氏菌病（Brucellosis），简称布病，是由布鲁氏菌（Brucella）引起的一种人兽共患传染病，以发热和流产为主要特征，流行于170多个国家和地区，对畜牧业发展和人畜健康构成较大威胁，我国将其列为二类动物疫病。本文重点介绍布病的病原学、流行病学，及诊断技术和疫苗的研究进展，旨在为布病的防控政策和净化措施的制定、新的诊断技术和疫苗的开发提供参考。
病原学
布鲁氏菌是革兰氏阴性兼性厌氧菌，属兼性胞内病原体。根据其生化特性、抗原成分、宿主特异性和对宿主致病性将布鲁氏菌分为10个种，包括羊种布鲁氏菌、绵羊种布鲁氏菌、牛种布鲁氏菌、猪种布鲁氏菌、犬种布鲁氏菌、沙林鼠种布鲁氏菌、田鼠种布鲁氏菌、鲸种布鲁氏菌、鳍种布鲁氏菌以及从人类乳腺中分离到的人布鲁氏菌。
羊种、绵羊种、牛种、猪种、犬种和鼠种布鲁氏菌为经典种，共有20个生物型，即羊种布鲁氏菌（3个生物型），绵羊种布鲁氏菌，牛种布鲁氏菌（9个生物型），猪种布鲁氏菌（5个生物型），犬种布鲁氏菌、沙林鼠种布鲁氏菌各1个生物型。经典种中羊种布鲁氏菌对人类的感染性最强。布鲁氏菌对外界环境抵抗力较强，但对热和一般化学消毒药比较敏感。
流行病学
布病主要流行于中东、拉丁美洲、亚洲、非洲和地中海盆地等牛羊养殖集中但经济技术相对落后的地区，每年约有50万新发人间病例，造成的经济损失约30亿美元。2004—2015年，我国家畜布病发病率居高不下，发病家畜主要以绵羊和牛为主，发病数量较多的省份有内蒙古、新疆、陕西、山西、湖北、山东和黑龙江等，其中内蒙古最为严重。
近年来，随着我国家畜饲养量的增加，人间布病发病数呈快速上升趋势。据国家卫健委官网信息，2019年1—10月我国共报告布病发病40743例，死亡1例，国内布病发病总数已超2018年全年。农业农村部、国家卫生计生委印发了《国家布鲁氏菌病防治计划（2016—2020年）》，为布病防控确立了目标并制定了原则和策略，不断推进全国布病防治、监测和净化，但受疫源分布广、活畜流动性大、基层防疫体系薄弱、淘汰病畜难度大、防治经费投入不足等因素影响，我国布病疫情仍然严重，防控形势十分严峻。
布病的传染源主要是患病动物和带菌者（包括野生动物），此外被布鲁氏菌污染的土壤、水源、病畜肉以及乳汁都可造成人畜的感染。本病的易感动物范围广泛，主要包括羊、牛、猪、犬、马、鹿、骆驼和鼠等，同时人也易感；传播途径主要包括皮肤黏膜、消化道、呼吸道等。本病潜伏期短则一周，长则数月甚至半年以上。感染本病的母畜主要临床症状为妊娠后期发生流产、早产、弱胎或死胎；感染公畜临床表现为睾丸炎、附睾炎和运动障碍；人感染布病的潜伏期为2周左右，初期症状与流感类似，主要表现为持续发热、多汗、无力和关节疼痛等，后期可能出现关节炎，严重者丧失劳动能力。
诊断技术研究进展
细菌学诊断技术
布鲁氏菌的分离培养是诊断布病的最基础方法，也是检测布病的“金标准”。但由于布鲁氏菌对环境和营养要求较高，还受动物感染阶段、样本中病原体数量及检测前抗生素使用等因素影响，常导致细菌污染，不能及时做出诊断而使病情加重。
布鲁氏菌的分离培养操作过程复杂，需要专业技术人员在生物安全三级以上实验室操作，分离操作过程存在较高的生物安全风险。因此，布鲁氏菌的分离培养一般不用于现场疫情的筛查和临床快速检测，仅用于个别动物的辅助诊断和流行病学追踪调查等。
血清学诊断技术
目前布病的血清学检测种类较多，但在国际上尚未有标准方法，常用的有常规血清学试验、补体结合试验（CFT）、酶联免疫吸附试验（ELISA）和荧光偏振试验（FPA）等。
常规血清学诊断技术。试管凝集试验（SAT）、虎红平板凝集试验（RBPT）和全乳环状试验（MRT）是3种常用的血清学试验。SAT于1897年开始应用，目前在发达国家已经停用，但在我国仍然是使用广泛的布病检测方法，该方法对IgM、IgG敏感性较高，可用于布病的早期诊断，也可用于疫苗免疫抗体的检测，对急性布病也有较好的检测效果。但该方法操作相对繁杂、耗时较长，不适用于现场快速检测。李翠等将SAT改进为微量试管凝集试验（MSAT），具有稀释方法简便、省时省力、节约抗原血清等优点。RBPT是一种经典的血清凝集试验，其抗原是将灭活布鲁氏菌菌体经虎红染料染色后悬浮于pH为3.7左右的乳酸缓冲液中制成。该方法敏感性较高、价格便宜、操作方便、检测快速，但特异性和准确性一般，受试验温度和凝集时间影响，不易准确判定结果，故常用于动物群体布病的普查和人布病的初筛及监测，而不作为确诊试验。MRT主要通过检测乳样中的布鲁氏菌抗体来筛查泌乳期牛群的布病，其本质是抗原抗体反应，当奶样中存在布鲁氏菌抗体时，与染成红色的布鲁氏菌抗原形成抗原抗体复合物，转移至乳脂层形成紫红色乳脂环。此方法操作简便、成本较低，常用于奶牛布病的现场筛查，但其敏感性较差，如检测牛群的大量乳样或者奶样中含有初乳时，可能导致假阳性反应。
补体结合试验（CFT）。CFT相对于常规血清学检测方法，具有敏感度高、特异性强的特点，是目前布病血清学诊断中最准确的方法之一。此外，CFT是国际贸易指定试验，也是世界动物卫生组织（OIE）公认的确诊方法，广泛应用于牛、羊、人布病的诊断，由于猪自身补体能干扰豚鼠补体，因此不适用于猪布鲁氏菌的检测。CFT的缺点是对试验条件要求较高、操作过程繁琐、检测结果受主观因素影响较大，因此不适用于基层和现场检测。
酶联免疫吸附试验（ELISA）。ELISA方法的特点是简便快速、特异性强、所需样品少且过程易标准化等，不仅可以用于大量样本的筛查，也可作为确诊试验。ELISA是国际贸易指定试验，于2004年被OIE列为诊断牛种布病的推荐方法。但是ELISA成本较高、对试验条件要求高，需在国家生物二级实验室内进行，不适用于基层和现场快速检测。
荧光偏振试验（FPA）。FPA通过将荧光素标记的小分子抗原加到待检血清或其他可能存在抗体的液体中，若存在相应抗体，抗体与标记抗原结合后会降低转速，通过仪器测量减速便可确定相应抗体的存在。FPA方法属于同源性分析，无需将分离物分离，因而简便快捷，是国际贸易指定试验。FPA诊断布病的敏感性和特异性与cELISA相近，但检测更快速，可在2min（血清）或15s（全血）内测定抗体含量。FPA在某些发达国家已经大量应用，成为检测动物布病快速、高通量的新技术，主要用于动物群体布病的检疫、筛查和净化。
分子生物学诊断技术
PCR检测技术。PCR技术因其检测特异性强、灵敏度高、操作简便等优势而在布病的检测和种型鉴别等方面应用日益广泛。目前主要的PCR方法有常规PCR、多重PCR、实时荧光定量PCR等。20世纪90年代常规PCR开始用于布病的诊断，该方法灵敏度高、特异性强，检测时间相对较短，可用于大量样品的检测。常规PCR可以作为人布病的常规检测方法，适用于临床症状明显但血清学检测为阴性的患者。多重PCR在同一反应体系内，加入2对或2对以上的引物，可以同时检测多种病原，除了具有灵敏度高、特异性强的特点外，还有准确性高、经济便捷等优点。实时荧光定量PCR是目前确定样品DNA拷贝数最敏感、最准确的方法之一，实现了DNA或RNA模板的精确定量，具有高度特异性、敏感性和可重复性。相比其他PCR方法，实时荧光定量PCR操作简便、不需电泳步骤，缩短了检测时间。但由于实时荧光定量PCR所需设备及试剂比较昂贵、对试验人员技能要求较高，不适用于基层推广。
环介导等温扩增技术（LAMP）。LAMP诊断布病，是针对布鲁氏菌的特异性基因序列设计引物，通过先扩增再分析的模式进行病原检测。但LAMP技术不需要苛刻的试验条件和专业的仪器设备，其结果判定通过肉眼可直接观察，整个检测过程可在1 h内完成，适合在布病的基层防控工作中使用。
疫苗研究进展
布鲁氏菌疫苗的研究最早开始于20世纪，早期曾使用灭活疫苗用于人和动物的布病防控，后被免疫效果更好的弱毒疫苗取代。至今，尚无国际认可的针对人类的布病疫苗，很多国家对人类使用疫苗免疫存在异议。目前对于动物布病的防控，主要使用的是弱毒活疫苗。此外，基因缺失疫苗、DNA疫苗以及重组亚单位疫苗等新型疫苗处在研发试验阶段。
弱毒活疫苗
因活疫苗可以有效刺激机体产生细胞免疫应答，产生持久良好的保护效果，因此目前大部分成功应用的疫苗均为弱毒活疫苗。如牛种布鲁氏菌S19疫苗、粗糙型牛种布鲁氏菌RB51疫苗、羊种布鲁氏菌Rev1疫苗和猪种布鲁氏菌S2疫苗等。
牛种布鲁氏菌S19疫苗。S19疫苗在我国称为A19疫苗，主要用于奶牛的布病预防。S19菌种最初是1923年从美国一牛场分离并通过实验室培养而获得。目前国际上使用的S19疫苗是由美国科学家筛选到的对赤藓糖醇敏感的菌株，由于菌株ery基因缺失，使毒力进一步减弱、安全性更高。S19疫苗的生产和使用需要穿戴必要的防护装备，但近年来仍有疫苗生产和接种过程中造成人员感染的事件发生。因此，对S19疫苗的研究方向主要是对其进行基因改造，既保留其免疫原性又能降低其毒力。
粗糙型牛种布鲁氏菌RB51疫苗。RB51疫苗菌株是19世纪80年代末由美国科学家研制的粗糙型突变株。RB51疫苗对牛的安全性比S19疫苗高，但对怀孕母牛静脉注射疫苗仍可引起25%的个体出现早产现象，且仍能造成人的感染。此外，RB51菌株具有利福平抗性，而利福平却是治疗布病最有效的药物之一，因此RB51疫苗的使用不利于布病的抗生素治疗。
羊种布鲁氏菌Rev.1疫苗。Rev.1疫苗菌株是美国科学家将羊种布鲁氏菌6056野毒株在链霉素抗性培养基上反复传代获得的光滑型变异株，主要用于绵羊及山羊的布病防控。Rev.1疫苗相比S19疫苗提供的免疫保护更强，抗体持续时间更长，但其毒力也比较强。研究表明，采用黏膜免疫方式接种Rev.1疫苗可以到达与皮下接种相近的免疫效果。但黏膜免疫方式的开放性，增加了操作人员感染风险。
猪种布鲁氏菌S2疫苗。S2疫苗菌株是中国兽医药品监察所由进口母猪流产胎儿中分离的布鲁氏菌，经传代培养获得的光滑型弱毒株。S2疫苗毒力较S19和Rev.1疫苗弱，对羊、牛、猪均能产生良好的免疫保护，其最大的优点是通过口服接种方式不会引起母畜流产。S2疫苗除口服免疫方式外，还可以通过肌肉注射、皮下注射和黏膜免疫等方式接种羊、牛、猪以及牦牛等动物，但注射方式不能用于牛、小尾寒羊和怀孕母畜。
新型疫苗
随着分子生物学及重组DNA技术的发展，研发新型疫苗成为近年来的研究热点。
基因缺失疫苗。基因缺失疫苗的安全性高，因其遗传背景清楚，可以通过病原学和血清学方法区分疫苗免疫和野毒感染。目前鉴定出的布鲁氏菌毒力基因已经超过180个，这为基因缺失疫苗的研制奠定了基础。研究结果表明，疫苗产生的保护力与其毒力正相关。因此在疫苗研发过程中，可以综合考虑疫苗的安全性、毒力及保护力等因素，对分离野毒株、强毒株进行基因缺失或者对现有活疫苗进行优化。
DNA疫苗。布鲁氏菌属于胞内寄生菌，机体的细胞免疫是控制其感染的关键，因此布病DNA疫苗的候选分子主要为能刺激T细胞引起细胞免疫的分子。DNA疫苗缺点是免疫效果差且单独使用不易诱导产生特异性免疫应答，其用于人和动物的具体效果还有待验证，目前尚无DNA疫苗能完全取代弱毒苗。
重组亚单位疫苗。重组亚单位疫苗与传统疫苗相比，具有安全性高、抗原成分单一、常规血清学方法可以鉴别等优点。2010年Kazak等利用L7/L12制备的亚单位疫苗在临床上诱导了Th1型免疫应答，但重组亚单位疫苗研发成本较高、生产工艺复杂、免疫效果不佳。为增强免疫效果，可将几个蛋白或多个有效的多肽进行重组，该方法可以提高其免疫原性、增强其免疫效果。目前布鲁氏菌重组亚单位疫苗用于动物免疫的试验不多，研究尚处初级阶段。
讨论
目前，全球范围内布病疫情呈反弹趋势，随着畜牧业的集约化发展，以及牛羊及其产品的跨区域频繁调运，我国布病疫情虽然维持相对稳定水平，但每年总体发病数量仍然较高。国内外针对布病的诊断技术方法较多，目前主要采取多法并存、相互补充的方式，尚无能够独立确诊布病的方法。此外，建立能够区分疫苗免疫与自然感染的布病鉴别诊断技术对于布病的净化及控制具有较为重要的意义。
布病的防控要坚持免疫预防为主的策略，但现有疫苗各有优缺点，难以完全控制疫情发生，部分疫苗还会干扰后期实验室诊断。随着分子生物学技术的发展，在对布鲁氏菌致病性及免疫原性深入研究的基础上，期待能够出现灵敏性高、特异性强、高效便捷且易推广的诊断技术。同时加强各类新型疫苗研发，研制出安全性高、副作用低、免疫效果好的疫苗，为布病的控制和净化服务。
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| 文章来源：马帅 等 中国动物检疫 文章编辑：一米优讯 |
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