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摘 要：基因编辑是指对生物体基因组特定的 DNA 进行改造，使生物的性状发生定向的、可遗传的改变。基因编辑技术主要包括锌指核酸酶（Zinc Finger Nucleases，ZFNs）技术、转录激活因子样效应物核酸酶（Transcription Activator-Like Effector Nucleases，TALENs）技术、成簇规则间隔短回文重复序列/Cas9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats and CRISPR-associated Protein 9，CRISPRs/Cas9）技术。在畜禽中使用高效且精确的基因编辑技术可以提高畜禽产量、品质、抗病力等。本文从基因编辑技术的发展、原理及其在畜禽遗传育种中的应用进行综述，为基因编辑技术应用于畜禽遗传育种的研究提供参考。
1 基因编辑技术
1.1 ZFNs基因编辑技术
最早利用核酸酶实现在预定位置附近进行基因编辑的技术是ZFNs技术。1985年在转录因子III中发现锌指结构。1996年首次将锌指蛋白与核酸内切酶连接形成ZFNs。
ZFN由两部分融合而成，一是DNA结合结构域，二是FokI核酸内切酶切割结构域。锌指结构能够识别并结合特异DNA序列，FokI核酸内切酶二聚体可切断DNA双链生成DSB，断裂的DNA双链通过同源重组（Homologous Recombination，HR）或非同源末端链接（Nonhomologous End Joining，NHEJ）实现基因编辑。1个锌指蛋白可以识别并结合特定的3个连续的核苷酸，人为地将多个锌指蛋白连接在一起可识别并结合具有特定序列DNA片段。单个FokI核酸酶不能发挥切割作用，只有当其形成二聚体时才具有酶切活性。单个的ZFN无活性，只有当2个ZFN结合到正确的DNA序列上，FokI形成二聚体才具有切割活性。
ZFNs是第一代人为利用核酸酶进行基因编辑的工具，实现了在特定位点附近断裂DNA双链，使在特定位点进行基因编辑成为可能，但该技术存在着一些问题，如脱靶效应，导致错误的切割位置；由于锌指结构识别的特殊性，目前无法设计出识别任意一段DNA序列的ZFNs，选择编辑的基因位点会受到限制；ZFN设计复杂成本较高不适合推广使用。
1.2 TALENs基因编辑技术
转录激活因子效应物（Transcription Activator-like Effector，TALE）是从植物的黄单胞菌中提取出来的蛋白，具有识别特定DNA序列的功能。2010年，Christian等将TALEs的酸性转录激活结构域替换成FokI核酸内切酶构成TALEN，并证明其可用性。
TALENs由DNA识别TALE结构域和切割FokI结构域构成。TALE由核定位信号序列（Nuclear Localization Sequence，NLS）、介导DNA识别的重复区域、酸性转录激活结构域3个部分组成。介导DNA识别的每个重复序列由33~35个氨基酸组成。每个重复序列第12、13位氨基酸残基不同，称之为重复可变双残基（Repeat Variant Di-Residues，RVDs），1个RVD可识别1个特定的核苷酸。根据所要识别的DNA片段，将相应的RVD串联起来，即可结合到特定的 DNA片段。由于TALEN的切割结构域使用的是核酸酶FokI，因此，只有成对的TALEN 才具有切割活性。
相较于ZFNs，TALENs凭借识别位点的选择更加灵活、特异性强、操作简便的特点，成为第二代基因编辑工具。但TALENs技术也存在一些问题，如体积较为庞大，构建过程繁琐，1对TALEN无法编辑多个基因，目前多用于单基因敲除，存在些许的脱靶效应。
1.3 基于CRISPR的基因编辑技术
Jansen等在各种细菌和古细菌中发现碱性磷酸酶附近存在串联间隔重复序列，并将其命为 CRISPR。Horvath等证实嗜热链球菌的噬菌体抗性与CRISPR和Cas蛋白有关。Makarova 等揭露CRISPR/Cas系统的分子机制。Jinek等将tracrRNA、crRNA融合形成sgRNA，同时将Cas9蛋白进行优化，实现在特定位点使DNA双链断裂，开启了使用CRISPR/Cas9技术进行基因编辑的大门。科学家在对CRIPSR/Cas9技术的深入研究的同时，开发出了精确的碱基编辑新技术：碱基编辑器（Base Editor，BE）和先导编辑系统（Prime Editor，PE）。
1.3.1 CRISPR/Cas9
CRISPR/Cas9是细菌和古细菌的 一种不断进化的适应性免疫防御机制，该机制能够抵抗 病毒与噬菌体的入侵，该系统主要由5'端tracrRNA（Trans-activating crRNA，tracrRNA）、一系列Cas蛋白编码基因、3'端CRISPR基因3部分构成。3'端的CRISPR基因序列由3部分构成，为前导区（Leader）、多个不连续的重复序列区（Repeat）、多个间隔区（Spacer）。CRISPR/Cas9的工作过程可以概括为3个阶段，第1阶段为间隔序列的获取：当外源 DNA 入侵细菌时，Cas蛋白会将外源基因切割并整合到CRISPR序列中，形成新的重复间隔序列（Protospacer）；第2阶段为基因座的表达：当同类DNA 再次入侵时，前导区发挥启动子的作用启动CRISPR转录，形成pre-RNA，随后加工形成crRNA，crRNA与 tracrRNA具有互补序列，2者结合形成双链二级结构，与Cas9蛋白结合形成复合体；第3阶段为外源DNA的切割：形成的三聚复合体具有特异性识别PAM（Protospacer Adjacent Motif，PAM）序列的作用，Cas9蛋白的2个核酸切割区域能够切断DNA双链引发细胞内基因修复机制（HNH 结构域切割与间隔序列互补的外源DNA链，RuvC结构域切割含有PAM序列的外源DNA链）。
1.3.2 Base Editor
使用CRISPR/Cas9技术会导致DNA双链断裂，用该技术对基因进行编辑会导致不同的indels（Insertion/Deletion，Indel），形成多基因型嵌合突变体。为解决上述问题，2016年刘如谦团队开发出基于CRISPR系统的单碱基编辑器，这种基因编辑的特点是不需要DNA双链的断裂即可进行单碱基替换，并且不需要提供DNA重组修复的模板。碱基编辑器有胞嘧啶碱基编辑器（Cytosine Base Editor，CBE）和腺嘌呤碱基编辑器（Adenine Base Editor， ABE）2种。
CBE 可以在基因组靶位点上实现C>T碱基的替换，由4部分组成：将C碱基转化成U碱基的胞嘧啶脱氨酶、结合到目标DNA上的经过修饰的Cas9蛋白（dCas9）、引导Cas9-胞嘧啶脱氨酶到目标基因座的sgRNA、抑制U碱基转换成C碱基的UGI（Uracil Glycosylase Inhibitor，UGI）。CBE系统通过sgRNA引导dCas9-胞嘧啶脱氨酶结合到靶DNA上，dCas9不具有切割活性，胞嘧啶脱氨酶使靶位点上的C碱基脱氨形成U碱基，DNA复制时，U碱基被替换成T碱基，从而实现CG>TA碱基对的替换。
尿嘧啶和胸腺嘧啶分别由胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶的自发水解脱氨形成，可导致CG>TA突变，该类型的突变占所有已知致病性单核苷酸多态性（SNP）的 大约一半，因此将目标位点的AT碱基替换成CG碱基可以纠正一部分人类疾病相关的SNP。已有的腺嘌呤脱氨酶不能对DNA上的腺嘌呤脱氨，Gaudelli等通过定向进化筛选的方法获得一种转移性RNA腺苷脱氨酶（TadA），TadA与CRISPR-Cas9 突变体融合时，可以使DNA上的腺嘌呤脱氨。ABE催化腺嘌呤脱氨形成肌苷，肌苷被聚合酶处理为鸟苷，在DNA复制之后可将AT碱基对转化为GC碱基对。
1.3.3 Prime Editor
碱基编辑器只能实现C>T、A>G、G>A、T>C碱基的替换，无法进行其他碱基的替换，具有局限性。2019年，刘如谦团队利用先导编辑向导RNA（Prime Editing Guide RNA，pegRNA） 将nCas9（Cas9 nickase）和逆转录酶的融合蛋白引导至 目标基因位点进行基因编辑。pegRNA由3部分组成，第1部分为单链导向RNA（Single-guide RNA，sgRNA）；第2部分为引物结合位点（Prime Bingding Site，PBS）；第3部分为携带有目标基因位点编辑信息的逆转录模板。先导系统的工作原理为：首先nCas9蛋白和逆转录酶融合蛋白在pegRNA中的sgRNA序列的引导下与目标基因位点结合，其次含有PAM序列的DNA单链被nCas9蛋白切断，接着断裂的DNA单链充当引物与pegRNA上的PBS序列结合，逆转录酶以RT（Reverse Transcription，RT）序列作为模板开始逆转录，反应完成后，DNA切口处出现3'flap结构和5'flap结构，不含目标突变的5'flap更容易被结构特异性内切酶Flap endonuclease 1切除，且Exonuclease 1具有核酸外切酶的活性，可以将残余的5'flap碱基进一步切除，最后经过DNA链的连接和修复实现目标序列的编辑。
相较于ZFNs、TALENs，CRISPR/Cas9以及由其衍生来的基因编辑工具具有编辑效率高、构建简单、精准性高、序列要求低、能同时编辑多个基因等独特的优势，因此被称为第三代基因编辑工具。但CRISPR/Cas9基因编辑技术也存在许多的问题，其脱靶效应比 ZFNs、TALENs高；会有嵌合体突变动物的产生；编辑效率高低与靶点的选择有关；转基因动物个体的存活率低、不健康。
2.1 猪
中国是世界上最大的猪肉生产国和出口国，提高养猪业的生产效率和猪肉品质有利于我国养猪业的发展。已有研究表明肌生成抑制蛋白（Myostatin，MSTN）能够抑制成肌细胞的增殖，从而对肌肉的生长产生负调控作用，MSTN基因突变使动物的成肌细胞 数量增加，引起家畜的臀、肩、大腿等部位肌肉群发达从而呈现“双肌”性状，因此使用基因编辑技术破坏家畜的MSTN基因有望提高生产性能。Wang等使用CRISPR/Cas9系统获得猪胎儿MSTN基因突变的成纤维细胞，再结合体细胞核移植（Somatic Cell Nuclear Transfer，SCNT）技术获得MSTN双等位基因敲除猪，发现MSTN突变仔猪的出生体重比同窝野生型仔猪增 加 15%，并且背最长肌有更多的肌纤维核。2016年，Bi等使用CRISPR/Cas9结合Cre/LoxP重组系统获得MSTN基因突变的猪，被编辑的猪骨骼肌发育增强，同时背部脂肪厚度减小。n-3不饱和脂肪酸脱氢酶由脂肪酸脱氢酶1（Fat1）基因编码，可将多不饱和脂肪酸从n-6转化成n-3。n-3多不饱和脂肪酸只能从食物中获取，2016年，Tao等使用ZFN技术在猪的基因组中插入外源Fat1基因，使n-3多不饱和脂肪酸含量更高。胰岛样生长因子2（Insulin-like Growth Factor-2，IGF2）是一种重要的生长因子，可以促进哺乳动物胎儿期和出生后的生长发育。Song等使用CBE破坏猪的MSNT和CD163基因，并引入有益的IGF2双等位基因，显著提高了猪的生产性能和抗病性。
NANOS2基因是雄性生殖特异性基因，公猪缺少NANOS2基因可以正常生长但不育。2017年，Park等使用CRISPR/Cas9技术敲除普通公猪的NANOS2基因，并将优良公猪的精原细胞移入NANOS2基因敲除的公猪中，发现基因敲除公猪开始产生优良公猪的精子。BMP15基因是调控单胎动物排卵率和产仔数的关键基因。2020年，Shi等使用CRISPR/Cas9系统获得BMP15单或双等位基因敲除猪，发现双等位基因敲除的猪不育，不育的原因包括卵泡发育停滞、颗粒细胞丢失以及卵母细胞异常，并且无明显的发情周期。
猪传染性疾病给世界养猪业带来巨大的经济损失，利用基因编辑技术提高猪对传染性疾病的抗性有助于 养猪业的发展和经济的稳定。猪繁殖与呼吸道综合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS）是感染猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus，PRRSV）引起的疾病，该病对母猪及仔猪健康有很大影响。研究发现CD163基因表达的受体是PRRSV进入宿主细胞的关键受体。2018年，Wu等使用CRISPR/Cas9系统结合SCNT技术获得CD163基因敲除的杜洛克猪，CD163双等位基因敲除猪对PRRSV有完全抵抗性。非洲猪瘟（Africans Wine Fever，ASF）对野猪和家猪的致死率高达100%，目前没有疫苗或其他治疗方法来抑制非洲猪瘟病毒（Africans Wine Fever Virus，ASFV）的感染。2018年，Hübner等使用靶向ASFV-p30基因的CRISPR/Cas9 系统对野猪肺细胞系（Wild Boar Lung Cell Line，WSL）进行编辑，发现ASFV产量降低了 4 个数量级，为治疗ASF提供有效的措施。
2.2 牛
牛作为大型单胎哺乳动物，具有繁殖周期长、试验成本高等特点。在牛上使用基因编辑技术具有缩短育种周期、减少成本等作用。Luo等通过ZFNs技术破坏牛的MSTN基因，这些牛肌肉生长迅速，在1个月大时股四头肌肥大，并且出现“双肌”表型。Β-乳球蛋白（Beta-lactoglobulin，BLG）是牛乳和山羊乳中人类主要的过敏源，敲除奶山羊或奶牛基因组中的BLG基因有望让过敏者饮用牛奶和山羊奶。Yu等使用ZFNs技术成功使牛的BLG基因突变，开启了基因编辑技术在大型动物上的应用。Sun等通过ZFNs技术获得BLG双等位基因突变奶牛，并获得无BLG基因的牛奶，使牛乳过敏患者食用牛奶成为可能。牛场通常会对犊牛进行去角处理以便管理，Carlson等使用TALEN技术将荷斯坦牛基因组中引入PC无角基因， 获得5头基因编辑牛，其中2头纯合牛生长到10月龄仍未长角。2020年，Ortega等利用CRISPR/Cas9技术敲除牛的NONAG基因，以探究该基因缺失对滋养层和多能内细胞团的影响，发现NONAG基因对滋养层没有明显作用，主要影响多能内细胞团的分化与增殖。
金黄色葡萄球菌感染的奶牛会患乳腺炎，该病给奶牛业带来巨大的经济损失。Liu等使用ZFNickases成功将溶葡萄球菌素基因插入到β-酪蛋白基因座中，通过SCNT技术获得的克隆牛产出的牛奶中含有溶葡萄球菌素能够杀死金黄色葡萄球菌，为奶牛乳腺炎治疗提供新的方法。牛的结核病是由于感染牛分枝杆菌（Mycobacterium Bovis，M.bovis）造成的一种人畜共患病。Gao等使用Cas9n（Cas9 nickase）和SCNT技术获得天然抗性相关巨噬细胞蛋白1（Natural Resistance[1]associated Macrophage Protein-1，NRAMP1）基因敲入的杂合体小牛，小牛表现出较强的结核病抗性。才冬杰利用CRISPR/Cas9技术将牛肾上皮（MDBK）细胞中的低密度脂蛋白受体（Low Density Lipoprotein Receptor，LDLR）基因敲除，并用牛病毒性腹泻病毒（Bovine Viral Diarrhea Virus，BVDV）侵染MDBK细胞，发现敲除了LDLR基因的细胞只表达了少量的BVDV病毒蛋白，为防治牛感染BVDV提供思路。
2.3 羊
Crispo等通过显微注射技术在绵羊受精卵中注入针对绵羊MSTN基因的CRISPR/Cas9 表达载体，获得MSTN基因突变绵羊，表现出“双肌”表型。Zhou等在绵羊上使用CBE3系统模拟了细胞因子信号转录抑制因子（Suppressor of Cytokine Signaling 2，SOCS2）基因的自然突变（R96C），发现该基因突变的个体体重增加或体型增大。有研究表明在山羊BLG基因座敲入人乳铁蛋白基因（Human Lactoferrin，hLF），不仅能够去除过敏原，而且能够促进羊乳的人源化改造。Cui等使用TALEN技术敲除山羊的BLG基因，同时通过同源重组引入hLF基因，使该山羊作为乳腺生物反应器，用于大规模生产hLF。2017年，Zhou等使用CRISPR/Cas9系统获得BLG双等位基因敲除山羊，该山羊所产的奶中无BLG蛋白。
羊绒纺织品轻薄柔软而且保温性能良好，因此羊毛是绵羊和绒山羊的重要经济性状。已有研究表明成纤维生长因子（Fibroblast Growth Factor 5，FGF5）是调控毛发生长功能的重要基因，是毛发生长的负调控因子。王小龙等使用CRISPR/Cas9系统破坏FGF5基因，发现FGF5基因敲除的绒山羊次级毛囊更多、被毛更长。因此破坏绒山羊的FGF5基因可以有效地提高羊绒产量。2018年，Li等使用CBE对山羊FGF5基因的外显子1进行无义突变，获得FGF5基因敲除山羊，这些山羊表现出多毛性状。2020年，Zhang等使用CRISPR/Cas9系统和SCNT技术获得5只FGF5基因敲除的杜泊羊，这些羊的FBG5蛋白功能紊乱，表现为细毛产量高和活性毛囊密度大。
性别鉴定和增加产仔数也是生产中的重要一步。Boulanger等使用ZFNs技术证实 FOXL2基因是山羊的雌性性别决定基因。BMPR1B基因通过影响卵泡颗粒细胞的分化和卵泡的发育促进排卵，该基因的FecBB突变，是由于第764位发生了A>G突变，导致谷氨酰胺变成了精氨酸，该突变与家养绵羊的排卵率和产仔数的增加高度相关。Zhou等使用ABE成功在绵羊胎儿成纤维细胞的BMPR1B基因上引入FecBB突变，遗憾的是由于具有旁编辑效应，因此无法阐明该突变对表型的影响。
2.4 家禽
家禽能够快速生产优质蛋白，并且饲料转化率高，是重要的动物性蛋白来源。使用基因编辑技术可以对家禽进行性别控制、提高家禽肉品质以及剔除家禽产品中的过敏原，从而提高产品质量和生产效率。Park等使用TALEN技术将鸡原始生殖细胞中的卵清蛋白（Ovalbumin，OVA）基因成功敲除，并获得OVA单等位基因敲除鸡。Oishi等使用CRISPR/Cas9技术将产生卵清蛋白和卵黏蛋白的基因敲除，将蛋清中的这2种致敏成分剔除，使鸡蛋过敏的人有望食用鸡蛋。Oishi等使用CRISPR/Cas9 技术将人干扰素-β基因整合到鸡原始生殖细胞（Primordial Germ Cells，PGCs）OVA基因的翻译起始位点，基因编辑成功的原始生殖细胞产生配子，并产生具有OVA基因打靶的后代，并发现该后代生产的鸡蛋蛋清中人干扰素-β高度表达。Lee等使用CRISPR/Cas9 技术敲除鹌鹑的MSTN基因，基因编辑的纯合子鹌鹑具有胸肌和腿肌的重量增加、脂肪沉积少、饲料转化率高等特点，满足了生产者和消费者的需求。DMRT1是Z染色体连锁基因，也是睾丸决定因子。Lee等使用CRISPR/ Cas9技术敲除鸡的DMRT1基因，发现早期胚胎性腺朝雌性方向分化，但未实现功能性性反转。
禽白血病病毒（Avian Leukosis Virus，ALV）是一种能在禽类中引起肿瘤的逆转录病毒，在禽类中可以垂直和水平传播，给禽类养殖业造成巨大的经济损失。2017年，Lee等在DF-1鸡成纤维细胞中使用CRISPR/Cas9基因编辑技术对B亚型肿瘤病毒（Tumor Virus Locus B，TVB）基因进行编辑，使TVB受体的半胱氨酸结构域无法表达，赋予了细胞对ALV B亚群的抗性，并建立新的抗病毒感染的鸡细胞系。火鸡疱疹病毒（Herpesvirus of Turkeys，HVT）可以作为禽类疾病的载体生产重组疫苗。2019年，Zai等使用 CRISPR/Cas9 技术在HVT基因组中插入H9N2亚型禽流感病毒HA基因，获得rHVT-H9重组病毒，鸡对该重组病毒免疫后，对H9N2亚型禽流感病毒有良好的抗性。
3 小结与展望
传统的育种方式具有周期长、资源少、成本高、遗传不稳定等缺点，使用基因编辑技术能够有效解决上述问题，有利于开发具有有益性状的畜禽种质资源，同时基因编辑技术也是研究基因功能、构建动物模型的重要技术。从ZFNs到TALEN再到CRISPR/Cas9，基因编辑技术不断迭新，编辑效率得到了很大的提升，脱靶效率有所降低。此外由于人们对基因功能的认识有限，基因编辑的动物可能出现新的疾病，严重的会导致死亡。例如突变猪的MSTN基因可以提高猪的瘦肉率，有时也会导致猪的畸形，这可能是因为该基因还参与维持猪的其他功能。目前基因编辑技术仍在不断地发展，人们对于基因组学的研究也在不断地深入，相信在未来能够推动畜牧业朝着有益的方向发展。
作者简介：曹慧（2000-），女，河南南阳人，硕士研究生，研究方向为动物遗传育种与繁殖，E-mail：1214242108@qq.com*通讯作者：孙东晓（1972-），女，河北衡水人，博士，教授，研究方向为动物分子数量遗传学与奶牛育种，E-mail：sundx@cau.edu.cn
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