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作者：郭 焘 高 畅 尹 娜 王文文 王 园 齐景伟
导读：试验旨在研究添加复合植物提取物（CPE）对高精料饲粮条件下肉羊体外发酵参数的影响。采用单因素随机试验设计，共分1 个对照组（CON）和4 个试验组，每组3 个重复。对照组培养底物为基础饲粮，试验组在基础饲粮中添加20（Ⅰ组）、50（Ⅱ组）、80（Ⅲ组）、110（Ⅳ组） mg/kg CPE。分别在培养3、6、9、12 h及24 h测定pH、氨氮（NH3-N）浓度、菌体蛋白（BCP）含量及产气量。结果表明：①3 h时，Ⅳ组NH3-N浓度显著高于Ⅰ组和Ⅲ组（P<0.05）；6 h时，Ⅰ组NH3-N浓度显著低于CON、Ⅲ、Ⅳ组（P<0.05）；Ⅳ组NH3-N 浓度显著高于Ⅰ组及Ⅱ组（P<0.05）；12 h 时，与CON 组相比，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组NH3-N 浓度显著下降（P<0.05）；24 h 时，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组NH3-N 浓度均显著低于CON 组及Ⅳ组（P<0.05）。②3 h 时，Ⅰ组BCP 含量显著低于CON、Ⅱ、Ⅲ组（P<0.05）；6 h 时，Ⅲ组BCP 含量显著高于CON、Ⅰ及Ⅱ组（P<0.05）。9 h时，Ⅱ组及Ⅲ组BCP 含量显著高于其他各组，且Ⅱ组显著高于Ⅲ组（P<0.05）；12 h 时，与对照组相比，各试验组BCP 含量均显著提高。③3 h 时，Ⅲ组产气量显著高于CON组及其他各试验组（P<0.05）。6、9、12 h 时，与CON 组相比，Ⅱ、Ⅲ及Ⅳ组产气量均显著提高（P<0.05）；24 h时，与对照组相比，各处理组产气量均显著提高（P<0.05）。④多项组合效应指数（MFAEI）表明，当CPE 添加量为80 mg/kg 时，对体外瘤胃发酵的促进效果较好。综上所述，CPE 可促进肉羊体外瘤胃发酵功能，且添加量为80 mg/kg为最适添加剂量。全文已在《饲料工业》2024年第10期刊出。
国家关于禁牧、退耕还草及保护生态等一系列法律法规的颁布，都标志着天然放牧将受到限制，肉羊的养殖模式也转变为集约化舍饲模式。而在集约化养殖过程中为了满足市场对羊肉的需求量及提高经济效益，养殖企业通常采用高精料饲粮育肥，这种饲料结构虽然可提高育肥肉羊的生长速率，但长期饲喂高精料所引发的瘤胃功能损伤成为目前急需解决的重点问题。植物提取物是指通过物化方法从植物中提取的活性成分，具有抗病毒、抗菌及抗氧化等多种生物学活性，同时还具有不易产生耐药性、无残留及毒副作用小等特点[1]。目前，植物提取物作为瘤胃调节剂的作用已得到广泛关注。
瘤胃是一个天然发酵罐，其中含有种类繁多、数量庞大的瘤胃微生物，主要包括真菌、原虫及厌氧细菌等[2]。瘤胃微生物通过对饲料的发酵作用为反刍动物的生长和生产供能。另一方面，其发酵产生的二氧化碳及甲烷（CH4）等有害气体会对环境造成污染，从而造成动物生产性能的下降。植物提取物作为植物的次生代谢产物，对瘤胃微生物具有选择性的抗菌活性。因此，许多植物提取物都表现出可在一定程度上调控瘤胃微生物发酵的作用。肉桂醛是一种醛类化合物，存在于肉桂等植物中，可使用物理或化学方法从肉桂皮中提取，其具有抗病毒、抑菌及抗氧化等多种生物学功能[3]。崔乔等[4]研究表明，在肉羊饲粮中添加一定量的肉桂醛可降低体外瘤胃发酵液中CH4及氨态氮（NH3-N）浓度，并提高丙酸比例，降低乙酸比例及乙酸/丙酸。另有研究表明，在高精料饲粮中添加肉桂醛可调节肉牛瘤胃发酵，影响肉牛对饲粮中氮的利用[5]。丁香酚主要来源于丁香、肉桂叶挥发油，具有抗菌、抗氧化及抗炎作用。Matteo 等[6]研究表明，在泌乳中期奶牛饲粮中添加由丁香等物质构成的复合营养素可提高瘤胃总挥发性脂肪酸浓度。另有研究表明，在体外发酵高精料底物中添加植物酚类化合物可降低NH3-N浓度，增加产气量及总挥发性脂肪酸水平[7]。辣椒油树脂是从辣椒中提取、浓缩得到的一种暗红色油状液体，具有辛辣味[8]。An等[9]研究表明，辣椒油树脂可改善夏季水牛体内外瘤胃发酵特性。朱靖等[10]研究表明，辣椒碱可通过改变瘤胃菌群结构，影响瘤胃代谢物含量，改善瘤胃内环境。基于以上研究可知，单独添加肉桂醛、丁香酚或辣椒油树脂均可在一定程度上改善瘤胃发酵特性，但目前复合添加以上三者对肉羊瘤胃体外发酵参数的影响还鲜有报道。因此，本试验研究了肉桂醛、丁香酚及辣椒油树脂组成的复合植物提取物对肉羊瘤胃体外发酵参数的影响，筛选出最适添加量，为其应用于肉羊养殖提供参考。
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材料与方法
1.1 供体动物及试验材料
选取4 只体况相近体重为（35.20±1.45） kg、年龄为6 月龄的健康小尾寒羊母羊作为瘤胃液供体羊。发酵底物为风干粉碎后的基础日粮，基础日粮组成和营养水平见表1。复合植物提取物（CPE）有效成分含量为3.5%辣椒油树脂、5.5%肉桂醛、9.5%丁香酚。
表1 发酵底物组成及营养水平(风干基础)
注:1.每千克预混料含:铜200 mg、锌1 500 mg、锰1 500 mg、硒10 mg、钴20 mg、VA 23 000 IU、VD3 44 000 IU、VE 800 mg、钙3.2 g、NaCl 6.4 g。2.能量为计算值，其余营养水平均为实测值。
1.2 试验设计
采用单因素随机试验设计，共分为5 个处理组，5个采样时间点（分别为培养3、6、9、12 h及24 h），每个时间点3 个重复。对照组(CON)培养底物为基础日粮，试验组分别在基础日粮中添加20（Ⅰ组）、50（Ⅱ组）、80（Ⅲ组）、110（Ⅳ组） mg/kg的CPE。
1.3 体外发酵及样品采集
于晨饲前2 h通过口腔采集瘤胃液。将采集到的瘤胃液经4层纱布过滤，将滤液装到提前预热至39 ℃并盛有CO2 的保温瓶中，采集完毕后迅速返回实验室。将采集到的滤液与参照Menke 等[11]的方法配制人工瘤胃液按照1∶2 的比例混合，在此过程中持续通入CO2，以保持厌氧环境。体外产气装置采用人工瘤胃厌氧发酵系统（北京满仓科技MC-BMP-Ⅱ）。
采用体外批次培养法，发酵底物添加量为1 g 及对应的CPE，发酵液的总体系为60 mL，将瘤胃液和人工瘤胃液按照1∶2 的比例迅速加入提前预热并充满CO2的瓶子中，盖紧瓶塞后在水浴摇床上分别培养3、6、9、12、24 h，在各时间点结束后，将发酵瓶冰浴结束发酵。将发酵液摇匀后立即检测pH，测定完后将发酵液4 000 r/m 离心15 min，取0.5 mL 离心后的发酵液上清液装于4.5 mL 0.2 mol/L 盐酸的离心管中，用于固定氨氮。另取5 mL 摇匀的发酵液用于菌体蛋白（BCP）的测定，将所有待测样品均置于-20 ℃冰箱。
1.4 指标测定及方法
1.4.1 瘤胃发酵液发酵参数的测定
分别于培养3、6、9、12、24 h时，收集各组发酵液，并立即使用校正好的便携式pH计测定pH。NH3-N含量使用比色法测定[12]；BCP 含量通过考马斯亮蓝染色法测定。应用多项组合效应指数（MFAEI）对瘤胃发酵参数进行综合评定，其是不同处理的各项单项组合效应指数（SFAEI）的总和，计算公式如下[13]。
式中:A1——对照组在各时间点各指标数值；
A2——试验组在各时间点各指标的数值；
A3——试验组在各时间点各指标的数值的平均值；n——时间点数。
1.4.2 产气量的测定
使用人工瘤胃厌氧发酵系统对产气量（北京满仓科技MC-BMP-Ⅱ）进行测定产气量，产气测定时统计各时间点（3、6、9、12、24 h）的产气量。
使用人工瘤胃厌氧发酵装置进行产气量的测定，底物添加量为3 g，发酵液总体系为180 mL，机器提前预热至39 ℃，通完CO2加入样品和发酵液后，用夹子夹紧进料口的软管防止漏气，设置转速后启动机器，微电脑中记录产气量。
1.5 数据处理与统计分析
用Excel 2010 软件初步整理原始数据后，采用SAS 9.2 统计软件中GLM 模型进行单因素方差分析，并用 Duncan’s 法进行多重比较。试验结果以平均值及标准误（SEM）表示，P<0.05 为差异显著，0.05≤P<0.10为有趋势。
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结果与分析
2.1 复合植物提取物对肉羊体外瘤胃发酵液pH 的影响由表2 可知，在各个时间段，与对照组相比，各处理组间pH 均无显著差异（P>0.05），但随着发酵时间的延长，各试验组pH总体呈下降趋势。
表2 复合植物提取物对肉羊体外瘤胃发酵液pH的影响
注:同行数据肩标不含有相同小写字母表示差异显著（P<0.05），含有相同小写字母或无字母表示差异不显著（P>0.05）；下表同。
2.2 复合植物提取物对肉羊体外瘤胃发酵液NH3-N浓度的影响由表3可知，在3 h时间点时，Ⅳ组NH3-N 浓度显著高于Ⅰ组和Ⅲ组（P<0.05）；与CON组相比，各试验组NH3-N浓度均无显著差异（P>0.05）。在6 h时间点，Ⅰ组NH3-N 浓度显著低于CON、Ⅲ、Ⅳ组（P<0.05）；Ⅳ组NH3-N 浓度显著高于Ⅰ组及Ⅱ组（P<0.05）。在9 h时间点，各处理组间NH3-N浓度均无显著差异（P>0.05）。在12 h时间点，与CON组相比，试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组NH3-N浓度显著下降（P<0.05）；而Ⅳ组NH3-N 浓度显著高于其他各组（P<0.05），且Ⅱ组NH3-N 浓度最低。在24 h时间点，试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组NH3-N浓度均显著低于CON组及Ⅳ组（P<0.05），且Ⅱ组浓度最低。
表3 复合植物提取物对肉羊体外瘤胃发酵液NH3-N浓度的影响(mg/dL)
2.3 复合植物提取物对肉羊体外瘤胃发酵液BCP 含量的影响由表4 可知，在3 h 时间点，Ⅰ组BCP 含量显著低于CON、Ⅱ、Ⅲ组（P<0.05）。在6 h 时间点，Ⅲ组BCP含量显著高于CON、Ⅰ及Ⅱ组（P<0.05）。在9 h 时间点，Ⅱ组及Ⅲ组BCP 含量显著高于其他各组，且Ⅱ组显著高于Ⅲ组（P<0.05）。在12 h时间点，与对照组相比，各试验组BCP 含量均显著提高，且试验Ⅰ组显著高于其他组（P<0.05）。在24 h时间点，各组间BCP 含量均无显著差异（P>0.05）。
表4 复合植物提取物对肉羊体外瘤胃发酵液BCP含量的影响(mg/dL)
2.4 复合植物提取物对肉羊体外瘤胃发酵产气量的影响由表5 可知，在3 h 时间点，Ⅲ组产气量显著高于CON 组及其他各试验组（P<0.05）。在6 h 时间点，与CON 组相比，试验Ⅱ、Ⅲ及Ⅳ组产气量均显著提高（P<0.05），且Ⅲ组产气量显著高于Ⅰ及Ⅱ组（P<0.05）。在9 h 时间点，与CON 组相比，试验Ⅱ、Ⅲ及Ⅳ组产气量均显著提高（P<0.05），且Ⅲ组显著高于Ⅰ和Ⅱ组（P<0.05）。在24 h 时间点，与对照组相比，各处理组产气量均显著提高（P<0.05），且Ⅲ组产气量最高。
表5 复合植物提取物对肉羊体外瘤胃发酵产气量的影响（mL）
2.5 复合植物提取物对肉羊体外瘤胃发酵综合指数的影响由表6 可知，以CPE 添加量为0 为对照组，根据MFAEI 计算，当CPE 添加量为20、50、80 mg/kg 及110 mg/kg 时，均产生正向组合效应，整体比较下，当CPE 添加量为80 mg/kg 时，其MFAEI 值最大，因此80 mg/kg为最适添加量。
表6 复合植物提取物对肉羊体外瘤胃发酵综合指数的影响
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讨论
反刍动物的瘤胃液pH 是评定瘤胃发酵基础指标之一，可反映瘤胃内环境状态，过高或过低均会对瘤胃微生物生长产生影响，进而影响瘤胃发酵。研究表明，反刍动物正常的瘤胃pH 应为5.5～7.5[14]。本次体外发酵添加CPE 对发酵液pH 无显著影响，且pH（5.66～6.13）均在正常范围，随着培养时间的延长，发酵液pH 呈下降趋势。其原因可能是植物精油在酸性环境下可调控瘤胃发酵模式，从而对微生物起到选择性抑制作用，因此可使瘤胃处于一个正常的瘤胃pH范围[15]。NH3-N 是瘤胃微生物降解饲粮中蛋白质及氨基酸等含氮物质产生的，同时也是合成BCP的主要氮源，所以BCP 含量与NH3-N 浓度存在一定相关性，瘤胃中NH3-N 及BCP 的浓度是反映瘤胃氮代谢的重要指标。金恩旺等[16]研究表明，不同添加水平的植物提取物均会在一定程度上降低NH3-N 浓度。Cao[17]等通过体外试验研究表明，丁香油等植物精油均可在一定程度上降低NH3-N浓度。王洪荣等[18]研究表明，在山羊日粮中添加青蒿素提取物可降低其瘤胃液中NH3-N 浓度，增加BCP 含量。另有研究表明，瘤胃微生物所需NH3-N 的浓度应不低于5 mg/dL[19]。在本试验中，各处理组的NH3-N 浓度均高于推荐的最低浓度。综合NH3-N 浓度及BCP 含量来看，发酵12 h 及24 h 时，Ⅰ、Ⅱ及Ⅲ组的NH3-N 浓度均较对照组显著下降，且在发酵12 h 时，与对照组相比，各试验组的BCP 含量均显著提高。NH3-N 浓度的降低可能是由于添加植物提取物抑制了氨基酸去氨基作用从而降低发酵液中NH3-N 浓度[20]。另一方面，也可能是植物提取物中的活性成分发挥了驱原虫作用，饲料中的蛋白质可被瘤胃原虫分泌的脱氨酶降解生成NH3-N，但其自身并不能利用NH3-N来合成自身需要的蛋白质，且原虫可吞噬和消化大量的菌体蛋白，因此去除原虫可以防止氨在微生物和原虫之间循环，在一定程度上提高BCP 含量[21]。产气量被广泛应用于饲料评价试验中，瘤胃内的气体由微生物产生，瘤胃的产气量随着瘤胃微生物的活性的提升而呈增加趋势[22]。郭晨阳[13]等研究表明，在荷斯坦奶牛饲粮中添加复合植物提取物（由蒲公英、益母草、金银花及连翘构成）可显著调高其体外瘤胃发酵产气量。与本试验结果相似，添加不同水平的CPE均可在一定程度上提高产气量，其中试验Ⅲ组在不同时间节点的产气量均高于对照组。产气量的提高可能是由于植物提取物的活性成分抑制了原虫生长，增加了对纤维物质的降解，从而提高瘤胃产气量[13]。瘤胃发酵可通过多个指标进行评定，如瘤胃pH、NH3-N 及BCP 等指标，如果使用单一指标对瘤胃发酵效果进行评定均带有一定的片面性。为了能更加客观及综合评价底物对瘤胃发酵的影响，因此选用MAFEI来对同一处理组不同发酵时间的不同发酵参数进行综合评定。在本试验中，添加不同剂量的CPE均产生正组合效应，说明添加复合植物提取物可有效调节瘤胃发酵，且MFAEI由高到低排序为80 mg/kg组>110 mg/kg组>50 mg/kg组>20 mg/kg组，因此添加量为80 mg/kg 时，CPE 对瘤胃发酵的促进作用最好。
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结论
综合瘤胃pH、NH3-N 浓度、BCP 含量及产气量，分析MFAEI表明，该CPE最适添加剂量为80 mg/kg。
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