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2023年规模化猪场主要病原检测结果分析
赵文影，谢莉敏，李毅毅，卫璐璐，杨?倩，田克恭，张云静 *，逄文强 *
（国家兽用药品工程技术研究中心，河南 洛阳471003）
猪病毒性腹泻和繁殖障碍类疾病是影响养猪业生产的主要传染病，不同病原混合感染导致猪场死亡率升高、仔猪生长性能下降，严重制约养猪业的发展。2023年国家兽用药品工程技术研究中心对全国23个省市疑似腹泻或繁殖障碍类疾病感染的猪场送检样品进行检测，并对猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）和猪轮状病毒(ProV)阳性样品进行测序，分析造成各送检地猪场发病的病因、流行毒株，以期为猪场疫苗选择和疾病防控提供参考。
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材料和方法
INTRODUCE
1.1 材料
1.1.1样品来源
待检样品主要来源于疑似腹泻或繁殖障碍疾病感染的猪场，共7 345份样品，41个集团或猪场，由国家兽用药品工程技术研究中心收集。
1.1.2主要试剂
猪圆环病毒3型（PCV3）荧光定量检测试剂盒购自普泰生物公司，Easy Script? First-Strand cDNA Synthesis SuperMix反转录试剂盒购自北京全式金生物技术股份有限公司，Viral Nucleic Acid Extraction KitⅡ核酸提取试剂盒购自台湾旭基生物公司，Premix Ex Taq (Probe qPCR)试剂购自Takara公司。
1.1.3引物
猪流行性腹泻病毒（PEDV）鉴定引物按照行业标准SN/T 1699-2017，猪轮状病毒（PRoV）鉴定引物按照行业标准SN/T 2520-2010，猪δ冠状病毒（PDCoV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）和猪伪狂犬病毒（PRV）鉴定引物参照已发表文献，猪瘟（CSFV）鉴定引物按照国家标准GB/T27540-2011，猪圆环病毒2型（PCV2）鉴定引物按照国家标准GB/T35901-2018，猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）鉴定引物按照国家标准GB/T35912-2018和GB/T18090-2023，猪细小病毒（PPV）鉴定引物按照行业标准SN/T1919-2016，上述引物序列均由上海生工生物公司合成。
PEDV S基因测序引物参照已发表文献，PRoV VP7基因测序引物按照国家标准GB/T36871-2018，PRoV VP4基因测序引物由国家兽用药品工程技术研究中心自建， PRRSV NSP2和ORF5基因测序引物参照已发表文献，上述引物序列均由上海生工生物公司合成。
1.2 方法
1.2.1样品处理及核酸提取
组织：取病变交界处黄豆大小的组织，置于含1 mL灭菌PBS的EP管中，放入钢珠后，于组织破碎仪中研磨3 min，4 ℃、12 000 r/min离心3 min，取200μL的上清液按照Viral Nucleic Acid Extraction Kit Ⅱ核酸提取试剂盒说明书操作。
粪便拭子：向采集的拭子中加入1 mL灭菌的PBS，震荡混匀后，4 ℃、12 000 r/min离心3 min，取200μL的上清液按照Viral Nucleic Acid Extraction KitⅡ核酸提取试剂盒说明书操作。
血清和全血：血清无需处理，按照Viral Nucleic Acid Extraction KitⅡ核酸提取试剂盒说明书操作。全血在裂解后4℃、12 000 r/min离心3 min，取上清液后按照Viral Nucleic Acid Extraction Kit Ⅱ核酸提取试剂盒说明书操作。
1.2.2病原检测
PEDV、PRoV、TGEV、PDCoV、CSFV、PRRSV检测采用同一种RT-PCR反应条件和反应程序，反转录体系和条件按照Easy Script? First-Strand cDNA Synthesis SuperMix反转录试剂盒操作说明书进行cDNA的合成。qPCR反应体系按照Premix Ex Taq（Probe qPCR）试剂说明书进行，反应条件：95℃ 1 min30 s，95℃ 30 s，60℃ 30 s，共40个循环，在60℃时收集荧光信号。
1.2.3阳性样品扩增及测序分析
利用1.1.3项中测序引物对各病原阳性样品分别进行PEDV S基因、PRRSV ORF5基因和NSP2基因以及PRoV VP7基因和VP4基因扩增，并将扩增后PCR产物送至上海生工生物公司进行测序。运用SeqMan软件对产物序列进行拼接，获得各病原毒株的基因序列。参照已发表文献分别对各病原毒株进行基因型划分。
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结果与分析
INTRODUCE
2.1 猪主要病原检测结果与分析
2023年共计检测不同病原8 369份，PEDV送检样本量1 328份，阳性率为44.73%，位居首位，PRRSV送检样本量1 249份，阳性率为20.26%，位居第二，PCV3送检样本量666份，阳性率为13.21%，位居第三，PRoV送检样本量1 272份，阳性率为11.87%位居第四，CSFV、TGEV、PDCoV、PPV、PCV2和PRV的阳性率为0.43%～7.22%。详见表1。
2.2 不同病原地域分布特点
对造成猪场腹泻类病毒和PRRSV感染的地区进行分析（见表2和表3，仅展示送检样品量＞100份的省份），2023年共收到23个省份进行腹泻类病毒核酸检测，其中河南、湖南、江西和浙江4省份腹泻类病毒送检样本量最多，PEDV阳性检出率依次为15.71%、46.46%、14.53%和72.79%，PRoV阳性检出率为8.56%、26.51%、9.40%和4.76%；19个省份进行PRRSV核酸检测，其中河南、湖北、山西、浙江和湖南送检样本较多，阳性率依次为12.43%、19.89%、4.79%、34.56%和27.83%。上述结果提示，这些地区在进行猪场疫苗接种和生物安全防控方案制定时应密切关注PEDV和PRRSV的流行。
2.3 病毒性腹泻病原混合感染检测结果
对2023年不同腹泻类病毒混合感染的猪场进行统计（见表4）， 41个猪场中10个猪场混合感染PEDV和PRoV，8个猪场混合感染PEDV和PDCoV，3个猪场混合感染PEDV、PDCoV和PRoV，2个猪场混合感染PEDV、TGEV和PRoV，1个猪场混合感染PRoV和PDCoV。
2.4 不同病原阳性样品测序结果与分析
2.4.1 PEDV阳性样品测序结果与分析
对594份PEDV阳性样品，根据批次、采样地点的不同，共选择136份PEDV阳性样品进行S全基因扩增并测序，通过SeqMan软件拼接、剪切后，共获得136条PEDV S全基因序列。经PEDV S基因遗传进化分析显示（见图1）：136条PEDV S基因序列中127条属于GII型，占93%；8条属于S INDEL型，占6%；1条属于GI型，占1%。2023年PEDV感染猪场流行毒株以GII型为主，其次是S INDEL型毒株，同时个别猪场检出GI型毒株。
图1 PEDV阳性样品基因群分类
2.4.2 PRRSV阳性样品测序结果与分析
对253份PRRSV阳性样品，根据批次、采样地点的不同，共选择67份阳性样品分别进行PRRSV NSP2基因和ORF5基因扩增并测序，通过SeqMan软件拼接、剪切后，共获得57条ORF5基因序列，48条NSP2基因序列。基于ORF5基因遗传进化分析显示（见图2）：57条ORF5基因序列中33条属于Lineage1.8谱系类NADC30-like株，8条属于Lineage8.7谱系，6条属于Lineage1.5谱系NADC34-like株，4条属于Lineage5.1谱系，3条属于Lineage3谱系，3条属于欧洲型毒株。
基于NSP2基因序列分析显示（见图3）：48条NSP2基因序列中33条属于Lineage1.8谱系NADC30-like株，6条属于Lineage8.7谱系，5条属于Lineage5.1谱系，其余4条分别属于欧洲型和Lineage3谱系毒株。67份样品中46份样品均获得ORF5和NSP2基因序列，统计分析显示（图4）：56% PRRSV阳性样品属于Lineage1.8谱系NADC30-like株，28% PRRSV阳性样品属于各基因型重组毒株。2023年感染PRRSV的猪场流行毒株以Lineage1.8谱系NADC30-like株为主，其次是Lineage1.8谱系NADC30-like株+Lineage1.5谱系NADC34-like株重组株，同时临床上也存在欧洲型毒株的流行。
图2 基于ORF5基因PRRSV阳性样品基因型分类
图3 基于NSP2基因PRRSV阳性样品基因型分类
图4 基于ORF5和NSP2基因PRRSV阳性样品分类统计
2.4.3 PRoV阳性样品测序结果与分析对151份阳性样品，根据批次、采样地点的不同，共选择47份阳性样品进行VP4和VP7基因扩增和测序，通过SeqMan软件拼接、剪切后，共获得44条VP7基因序列，42条VP4基因序列。对PRoV VP7基因进行基因型分类（表4），22条VP7基因序列属于G9型，12条属于G4型，G5、G3、G1、G26和G12型均有检出。对PRoV VP4基因进行基因型分类（表5），20条VP4基因序列属于P[23]型，10条属于P[13]型，P[7]、P[6]和P[19]型均有检出。47份阳性样品成功鉴定出41份样品的G/P基因型，共有14种G/P基因型组合，G9P[23]型占34%，G4P[6]型占15%，G9P[13]型占10%，其他基因型组合各占2%～7%，详见图5。猪轮状病毒在猪群中分布广泛且基因型多样，2023年感染PRoV的猪场优势毒株基因型为G9P[23]型。
图5 2023年PRoV不同G/P基因型组合分布
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讨论
INTRODUCE
2023年对23个省市送检病料进行猪主要传染病病原检测，样品来源覆盖不同地区、不同养殖场，因此检测结果及毒株流行情况分析具有一定的代表性。2023年造成猪场发病的主要病原是PEDV和PRRSV，其次是PCV3和PRoV。PEDV主要流行毒株是GII型，PRRSV主要流行毒株是类NADC30毒株，这与2020年李相钊等发表的数据一致。2023年感染猪轮状病毒的猪场主要流行毒株G/P基因型是G9P[23]型，这与前人发表的数据一致。
造成猪群发生腹泻的病因很多，如病毒性腹泻、细菌性腹泻等。其中PEDV、PRoV、PDCoV和TGEV是造成仔猪病毒性腹泻的主要病原。2023年猪病毒性腹泻以猪流行性腹泻病毒为主，其次是猪轮状病毒和猪δ冠状病毒，这提示猪场在防控PEDV的同时，应同时关注其它腹泻相关病因。就PEDV流行趋势而言，猪流行性腹泻疫苗毒株建议选择GII亚群，密切关注猪群腹泻健康状态，提前采取措施，防患于未然。
猪轮状病毒是造成仔猪腹泻的第二大病原。轮状病毒共分为10个群，A、B、C、E和H群均可在猪群中检测到，其中A群轮状病毒流行率最高，迄今为止，RVA已鉴定出42种G型和58种P型。猪轮状病毒具有不同的血清型，不同血清型毒株之间交叉保护能力有限。2023年国家兽用药品工程技术研究中心主要对A群猪轮状病毒进行检测，阳性率高达11.87%。对检测的阳性病料测序分析发现，国内猪群中轮状病毒呈现多血清型、多基因型流行，目前，共监测到14种不同基因型组合形式的毒株在猪群中流行，其中G9P[23]型是主要流行毒株，商品化猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪轮状病毒三联活疫苗主要针对G5P[7]型猪轮状病毒毒株，这使得PRoV的防控更加困难。此外，国内对猪轮状病毒的监测多集中在G基因型，而忽视了P基因型。国家兽用药品工程技术研究中心对A群猪轮状病毒P型和G型毒株的监测，不仅丰富了国内PRoV研究资料，也为后期新型疫苗的研发提供数据支撑。
2023年猪场腹泻类病原混合感染的数据显示，送检猪场主要以PEDV和PRoV混合感染为主，其次是PEDV和PDCoV，PEDV、PDCoV和TGEV混合感染的猪场较少。因此，针对PEDV、PRoV、PDCoV和TGEV等病原造成的仔猪腹泻，猪场除制定合理疫苗免疫程序外，还应注意腹泻类病原的监测，加强生物安全和人员进出管理，栋舍内使用的工具和环境都需要消毒，粪便做无害化处理，减少猪场内不同栋舍之间病原交叉感染；最后，减少冷应激，注意对仔猪保暖防护。
2023年猪繁殖障碍类疾病以PRRSV为主，其次是PCV3，其他病原均有不同程度的检出。PRRSV流行毒株主要是类NADC30株，且在临床上极易发生重组。就PRRSV毒株流行趋势来看，建议猪场选择与感染毒株同源性较高的疫苗，但目前市场上还未有商品化类NADC30毒株PRRSV疫苗，而其他谱系PRRSV疫苗对流行毒株的保护能力有限。因此，针对该病，猪场除定期接种现有商品化疫苗外，还应严格控制引种监测和环境检测，严禁外来不同类型PRRSV毒株进入猪场，交叉感染造成严重经济损失。对于PCV3防控，目前还未有商品化疫苗。
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小结
INTRODUCE
2023年规模化猪场送检病料中PEDV和PRRSV阳性率最高，其次是PCV3和PRoV。
临床上PEDV主要流行毒株是GII型毒株，PRRSV主要流行毒株是类NADC30株，PRoV主要流行毒株是G9P[23]型毒株。说明猪场在制定防控方案时，PEDV、PRoV、PRRSV，以及PCV3应作为重点监测对象。
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